サザンブロット法と同様の技術をＲＮＡに適用する方法は、ノーザンブロットと呼ばれる。この場合には、ｍＲＮＡをゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレン等に移した後、放射性のRNAあるいは１本鎖DNAをプローブとしてハイブリッド形成を行い、もとのRNA断片の位置を決定する。また、今回もＴＯＹＯＢＯ社製のノーザンブロットキットのプロトコルを参考にして紹介をする。
１）ホルムアルデヒドアガロースゲルの作成
ゲル組成
- １．５ｇのアガロースゲルを７２ｍｌの無菌水に加えて電子レンジで溶かす。
- １０×bufferを１０ｍｌ加える。
- ドラフター内で１２．２Mのホルムアルデヒドを１８ｍｌ加えよく混合し、トレーに流しゲルを固める。
・泳動中のRNAを直鎖状にするためにアガロースゲルにホルムアルデヒドを加える。 - 固まったら１×MOPS bufferを加えて乾燥を防ぐ。
２）ＲＮＡ試料の調整
ホルムアミドで全量を２０μｌにする。このときホルムアミドはＡＧ-５０１-Ｘ８（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社製）混合樹脂で脱イオン化した後、フィルター滅菌する。
- ＲＮＡ量が２μｇ入るようにＲＮＡ溶液を調整する。
- 上のテーブルのものを１．５ｍｌチューブの中で調整する。
- ６５℃、１５分加熱し氷上に放置する。
・RNAを直鎖状にするために熱変性させる。 - オートクレーブ滅菌したゲルローディングｂｕｆｆｅｒを２μｌチューブの中に加えよく混合する。
３）実験方法
- 泳動槽の中に１×MOPS bufferを入れる。
- 泳動する前にゲルを平衡化するために5分間くらい空運転する。
- 調整したRNA試料を2.2Mホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動する。
- ゲル上のRNAをメンブレンに転写する。
・リン酸bufferが上部に移動するのと共に、ゲル中のRNAがナイロンメンブレンに転写される。
- メンブレンを80℃で１５分間乾燥し、UVをあててRNAを固定する。
- 厚めのポリ袋にメンブレンとハイブリダイゼーション溶液３mlを入れてシールし、42℃で２時間浸す。このときポリ袋の中の空気をぬいてから行う。
- ハイブリダイゼーション溶液を捨て、各プローブ1μlとハイブリダイゼーション溶液で再びシールし、42℃で一晩（16時間）ハイブリダイゼーションさせる。
・前述のサザンハイブリダイゼーションの時はプローブにDIGラベルを付ける工程を自分で行ったが、ノーザンハイブリダイゼーションの時はあらかじめビオチンラベルされたプローブを業者から購入した。
- メンブレンをポリ袋の中から取り出し、１×SSC,0.1％SDS溶液に浸して室温で５分間緩やかに振とうする。
・メンブレンを洗浄する。 - ８．の操作をもう一度行う。
・メンブレンを洗浄する。 - BL溶液に浸して室温で５分間緩やかに振とうする。
・BL溶液で、メンブレンを保護する。 - ポリ袋にメンブランとSA溶液（抗ビオチン抗体が含まれている）を３ｍｌ入れてシールし、室温で５分間激しく振する。
・ビオチンラベルされたプローブとハイブリッド形成したDNAを、抗ビオチン抗体と結合させる。
- メンブランを取り出し、W１溶液に浸して室温で５分間緩やかに振とうした。
・メンブレンを洗浄する。 - １２．の操作をもう１度行う。
- ポリ袋にメンブランと２０００倍希釈BA溶液（BA溶液1．5μｌを３mlのBL溶液に入れる。）を３ｍｌ入れてシールし、室温で５分間激しく振とうする。
・BA溶液には１９．の発光反応を触媒するホスファターゼが含まれている。 - メンブランを取り出し、W1溶液に浸して室温で５分間緩やかに振とうする。
・メンブレンを洗浄する。 - １５．の操作をもう１度行う
- W2溶液に浸して室温で５分間緩やかに振とうする。
・メンブレンを洗浄する。 - １７．の操作をもう１度行う。
- ポリ袋にメンブランとPPD溶液を３ｍｌ入れシールし、室温で５分間激しく振とうする。
- 感光板にメンブランを入れて発光させる。（３７℃の暗所で３０分間放置）
- X線フィルムをメンブランの上にのせて暗所で２時間感光させる。
- 現像する。
４）ノーザン分析の試薬の組成
