アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片を大きさに従って分離し、ＤＮＡをゲルからニトロセルロース膜へ移行させてハイブリッド形成を行い、特定のＤＮＡ断片を検出する。E.．M.．Ｓｏｕｔｈｅｒｎによって開発されたブロッティング方法である。ゲル中のＤＮＡ断片をアルカリ塩溶液に浸して変性させ、そのゲルごとニトロセルロースシート上に置く。そしてゲル上におもしをして置いて液を染み出させる。変性した一本鎖ＤＮＡ断片をニトロセルロースシートに結合させ、次にこれを放射性標識したＤＮＡあるいはＲＮＡプローブとハイブリッド形成させて位置を決定する。最近は多数のサザンブロットのキットが市販されているので容易に行うことができる。今回はＴＯＹＯＢＯ社製のサザンブロットキットのプロトコルを参考にして紹介をする。
１）プローブの作成
- ＰＣＲ反応組成
・DIGとは標識のことで、DIGラベルされたｄNTP（ここではウラシル）をPCR増幅によりDNAに取りこませる。
２）サザンハイブリダイゼーション
- 染色体ＤＮＡの前処理
３７℃で適当な時間制限酵素処理
- 0.8パーセントアガロースゲル電気泳動（ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ）
マーカーと各種制限酵素処理したＤＮＡをそれぞれのレーンで電気泳動する。電気泳動が終了し、エチジウムブロミドによる染色が確認できたら、脱イオン水に１０分くらい浸ける。
（アルカリ塩溶液の調整）
- ゲルをアルカリ塩溶液に浸し、３０ｍｉｎ（１０ｍｉｎ後、液を交換して２０ｍｉｎ）緩やかに振とうする。
・アルカリ処理をしてDNAを１本鎖にすることにより、DIGラベルされたプローブとDNAが結合（ハイブリダイゼーション）しやすくなる。
（脱イオン水で洗浄後、ゲルを中和溶液で共洗いする） - ゲルを中和溶液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ-HCl pH7.5、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸し、３０ｍｉｎ（１０ｍｉｎ後、液を交換して２０ｍｉｎ）緩やかに振とうする。上部のキシレンシアノールが緑から青に戻る。
（脱イオン水で洗浄後、１×ＴＢＥで共洗いする） - １×ＴＢＥに３０ｍｉｎ浸す。また、ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ‐Ｎ_（Amersham社製）を同様に１×TBEに浸す。
- ．ゲル上のDNAをメンブレンに転写する。
1×TBE溶液が上部に移動すると共に、ゲル中のDNAがニトロセルロール膜に転写される。
- メンブレン上のDNAをこていするために、メンブレンをキムタオルで包んでガラス容器にのせて８０℃で１時間放置する。その後、UVを５minあてる。
（８０℃で１時間放置中にハイブリダイゼーション溶液の調整）
- 厚めのポリ袋にメンブランとハイブリダイゼーション溶液５ｍｌを入れて６２℃で２時間浸す。
・メンブレンが乾燥している状態なので、後に行うハイブリダイゼーションのためにメンブレンをハイブリダイゼーション溶液になじませる。
- ２時間の１０分前にプローブの熱変性を行う。（９５℃で３分）
プローブは１０ng/ml（２０μｌ）あれば十分である。
・熱変性させてDNAを１本鎖にすることにより、DNAとDIGラベルされたプローブが結合（ハイブリダイゼーション）しやすくなる。 - ２時間後、ハイブリダイゼーション溶液を捨て、新しいハイブリダイゼーション溶液５ｍｌと先程のプローブをいれて再びシールし、６２℃で一晩ハイブリダイゼーションさせる。
- メンブランを取り出し、脱イオン水で洗った後、１×SSC，０．１％SDS溶液に浸し、室温で５分軽く振とうする。（２回）
（脱イオン水で洗浄後、buffer１で共洗いをする） - buffer１溶液に浸し、室温で５min軽く振とうする。
・メンブレンを洗浄する。
（ｂｕｆｆｅｒ２溶液の調整）
ｂｕｆｆｅｒ２溶液５０ｍｌ分
ｂｕｆｆｅｒ１溶液にブロッキング試薬を１％（w/v）になるように加える。
- ｂｕｆｆｅｒ２溶液に浸し、室温で３０ｍｉｎ軽く振とうする。
・メンブレンを洗浄する。また、ブロッキング試薬によりメンブレンを保護する。 - ｂｕｆｆｅｒ２溶液でフラッシュ遠心した抗体の上清を適当な濃度に希釈し、室温で３０分激しく振とうする。抗体の上清０．５μｌにｂｕｆｆｅｒ２溶液１ｍｌを加え、ｂｕｆｆｅｒ２溶液４ｍｌをシールしたゲルに加え、抗体入りｂｕｆｆｅｒ２溶液１ｍｌを加える。
・DIGラベルされたプローブとハイブリッド形成したDNAを、抗DIG抗体と結合させる。
（洗浄ｂｕｆｆｅｒ溶液の調整）
洗浄ｂｕｆｆｅｒ溶液１００ｍｌ
ｂｕｆｆｅｒ１溶液にＴｗｅｅｎ２０を０．３％（ｗ/ｖ）になるように加える。
Ｔｗｅｅｎ２０（０．３％） ０．３ｇ
- ｂｕｆｆｅｒを捨て、洗浄ｂｕｆｆｅｒに浸し、室温で１５分緩やかに振とうする。（２回）
- 脱イオン水で洗浄し、ｂｕｆｆｅｒ３溶液に２分浸す。
- ｂｕｆｆｅｒ３溶液５００μｌとルミホス１０μｌ（直前に混ぜる）をメンブランと一緒にポリ袋に入れてシールする。暗所に１時間置き（３０℃の恒温室）発光させる。
・発光の原理
- Ｘ線フィルムを暗所で一晩感光し、現像する。
３）試薬の調整
