研究テーマ
1） 両生類精原細胞 の増殖と減数分裂開始機構
Mechanism of spermatogonial proliferation and their entrance into meiosis in amphibians
2） プロラクチンによるイモリ精原細胞のアポトーシス誘起機構
Mechanism of apoptosis induction in newt spermatogonia by prolactin
3） 魚類の性分化および性転換機構
Mechanism of sex differentiation and sex reversal in fish

 
1）両生類精原細胞の増殖と減数分裂開始機構
　精子分化過程は、精原細胞が体細胞分裂を一定回数行ったのち減数分裂を開始して第一精母細胞に分化し、２回の減数分裂を完了し、複雑な形態形成過程を経て精子に分化する一連の過程から成ります。精原細胞の増殖と減数分裂の開始の機構は、まだ明らかになっていない重要な問題の一つです。この問題にはホルモンやセルトリ細胞という体細胞が重要な役割を果たしています。我々は、イモリ精巣の器官培養系、及び再構成培養系を確立し、ＦＳＨ(follicle-stimulating hormone:濾胞刺激ホルモン)の処理によって、精原細胞の増殖を促進し、第一精母細胞への分化を起こさせることに成功しました。この培養系を用いてセルトリ細胞から分泌される増殖因子の同定を行っており、IGF (insulin-like growth factor) とSCF (stem cell factor) が関与していることを明らかにしています。
　イモリ精原細胞は７回目の分裂を完了すると第８世代で減数分裂に入りますが、基本培地での培養では第７世代まで進行しますが、最後の分裂を完了できずにアポトーシスを起こします。このことから、第７世代に減数分裂開始のチェックポイントがあると考えられます。ＦＳＨの作用によりセルトリ細胞から減数分裂開始因子が分泌されることにより７回目の分裂を完了して減数分裂に入るものと考えられます。
 
 
Mechanism of spermatogonial proliferation and their entrance into meiosis in amphibians
Spermatogenesis consists of a series onts, a definite number of mitotic divisions by spermatogonia followed by initiation of meiosis which results in differentiation into primary spermatocytes, meiotic divisions and complex morphogenesis, eventually culminating in mature sperm. Mechanism of spermatogonial proliferation and meiosis initiation is one of the important issues to be clarified yet. Hormones and somatic cells such as Sertoli cells are deeply involved in the problem. We succeeded in establishing organ and reconstituted culture systems in which addition of follicle-stimulating hormone (FSH) alone stimulates spermatogonial proliferation and induces their differentiation into primary spermatocytes in newt. Growth factors for the spermatogonia involved are clarified to be IGF (insulin-like growth factor) and SCF (stem cell factor).
Newt spermatogonia undergo 7 times mitotic divisions and enter meiosis in the 8th generation. In basal medium spermatogonia proceed until the 7th generation but fail in the last division, and instead undergo apoptosis. From these results there seems to be a checkpoint for meiosis initiation in the 7th generation. It is considered that spermatogonia accomplish the 7th (last) division and enter meiosis by meiosis initiation factor that is secreted by Sertoli cells that are activated by FSH.
 
2）両生類精原細胞のアポトーシス誘起機構
　ヒツジプロラクチンをイモリ腹腔に注射すると、第７世代の精原細胞がアポトーシスを起こすことを見出しました。これはプロラクチンの新しい作用の発見です。イモリを低温で飼育すると精原細胞が死にますが、これは血中のプロラクチン濃度が 上昇することによるものであることを証明しました。さらに、精巣の器官培養において、プロラクチンがイモリ精巣に直接作用して精原細胞のアポトーシスを引き起こすことと、プロラクチンとFSHの作用は拮抗的であることを示しました。この現象は、秋に精子形成が完了するとその後の精母細胞形成を停止させるという生理的意義があると思われます。
　このアポトーシスにはcaspase 3とcathepsinが関与することを示しました。
 
Mechanism of apoptosis induction in newt spermatogonia by prolactin
We found that intraperitoneal injection of prolactin into newts causes apoptosis in the 7th generation of spermatogonia. This is a finding of new action by prolactin. We demonstrated that spermatogonial death in newts incubated at low temperature is caused by elevation of prolactin concentration in plasma. Furthermore we showed that prolactin causes spermatogonial apoptosis by acting directly on the testis and that actions by prolactin and FSH are antagonistic, using organ culture of newt testis. This phenomenon has a physiological significance that when spermatogenesis completes in autumn spermatocytogenesis stops.
We showed that cathepsin as well as caspase-3 are involved in the apoptosis.
 

３） 魚類の性分化および性転換機構
　ヒラメの性は基本的にＸＸ(♀)とＸＹ(♂)によって決定されます。しかしながら、性分化時期の温度や性ホルモン処理により容易に性転換を誘導することができます。したがって、ヒラメは、性分化及び性転換機構を調べる上で、大変有効な実験動物です。性分化における性ホルモンの役割を明らかにするため、ヒラメからアロマターゼ(アンドロゲンをエストロゲンに変換する酵素)、エストロゲンレセプターaとb、11b-水酸化酵素(魚類特異的アンドロゲンである11-ケトテストステロンの合成に関与する酵素)の遺伝子を単離し、温度コントロールにより誘導した雌雄の生殖腺におけるこれら遺伝子の発現を調べました。その結果、アロマターゼ遺伝子の発現は、性分化開始以降、雌では急激に増加しましたが、雄では減少しました。一方、11b-水酸化酵素遺伝子の発現は、雄においてのみ、性分化後に増加しました。さらに、性分化時期の遺伝的雌にアロマターゼ阻害剤または抗エストロゲン剤を投与することで生理的雄へと性転換したことから、雌への性分化にはエストロゲンが不可欠で、雄への性分化にはエストロゲン合成の抑制が重要であると考えられました。現在、アロマターゼ遺伝子の発現制御機構の解析及び雄への分化誘導因子の探索を行うと同時に、メダカを用いた機能解析システムの開発にも着手したところです。

Mechanism of sex differentiation and sex reversal in fish
The genetic sex determination mechanism in the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) is basically XX(female)-XY(male) type. The genetic females can be sex-reversed to phenotypic males by rearing the larvae at high or low water temperature or by treatment with sex steroid hormones during the sex differentiation period. Therefore, the flounder provides an excellent model to elucidate the mechanism of sex differentiation and sex reversal.
To address the roles of sex hormones in gonadal sex differentiation, we isolated cytochrome P450 aromatase (P450arom, an enzyme that catalyzes the conversion of androgens to estrogens), estrogen receptor-_ (ER__, ER_, and 11_-hydroxylase (P45011_, the first enzyme involved in fish-specific androgen synthesis such as 11-ketotestosterone) cDNAs and examined their expression patterns during gonadal sex differentiation period. After the initiation of sex differentiation, the level of P450arom mRNA increased rapidly in the female gonad, whereas it decreased slowly in the male gonad. In contrast, P45011_ mRNA level increased only in the male gonad after the sex differentiation. Moreover, treatment of an aromatase inhibitor or an ER antagonist induced the masculinization of the genetic females. These results indicate that estrogen is indispensable for ovarian differentiation, whereas diminution of estrogen biosynthesis is important for testicular differentiation. We are currently studying on the regulatory mechanism of P450arom gene expression and searching inducer(s) for testicular differentiation.